Sang-Jin Park1†, EunHyeJung1, Ran-SukRyu1, Hyun WoongKang2, Jung-Min Ko3, HyonJ Kim3, Chong Kun Cheon4, Sang-Hyun Hwang5and Ho-Young Kang1*†* 通讯地址: mgmed@naver.com† 作者对文章的贡献相同1 韩国首尔MG MED公司全部作者的信息见文章末尾摘要
背景：微阵列比较基因组杂交（CGH）是迄今为止检测常等才能被GTG带型分析技术检测出来。20年以来，研围产期临床病例染色体变异的最有效方法。在本研究中，究者将各种传统的带型分析技术和分子遗传学技术结合我们开发了一种以BAC为基础的微阵列CGH分析平台，起来，改善了检测的分辨率，使整个基因组的改变都能用于检测包括特异性微小缺失和重复染色体障碍在内的检测。和传统及分子细胞遗传学的方法相比，微阵列C
GH技术具有很高的分辨率和优越的流量。在微阵列CG全基因组DNA拷贝数目变异。此外，我们还报告了该
微阵列CGH分析平台的临床使用经验。我们从具有各种H中，可采用不同荧光染液对来自患者的基因组DNA及临床表现型的患者中采集了5080份围产期的临床样本，参比品进行标记，并和含有克隆DNA的微阵列基质进
行共杂交。微阵列的内容物可包括基因组的特异性靶向并进行了微阵列CGH分析。
区域或整个基因组，均可排列在一个玻片上。阵列中可放置的克隆的大小和数目决定了微阵列CGH检测基因组结果：总共对4073份产前样本（4033份羊水样本和40
份绒毛膜绒毛样本）和1007份产后样本（407份外周血拷贝数目变化的分辨率。全基因组或靶向微阵列CGH是样本和600份脐血样本）进行了研究，这些样本的微阵一种有效的工具，可准确检查末端着丝粒下的染色体重列CGH、核型和荧光原位杂交的检测结果均一致。在7排。和传统及其它分子细胞遗传学技术相比，微阵列C5例DNA拷贝数目有变异的产前阳性样本中，60例存在GH的分辨率更高，其临床用途也更强。微阵列CGH技
术可成功检测DNA拷贝数目的改变。有数个小组研究非整倍染色体，7例存在染色体缺失，8例存在染色体
重复。在39例阳性的产后样本中，5例存在非整倍染色了该技术在围产期样本中的临床使用【5-9】。最近，
国际标准细胞基因组微阵列（ISCA）协会发表了共同体，23例存在染色体缺失，11例存在染色体重复。
宣言，同意将染色体微阵列技术作为一线诊断检验，用
结论：本研究证实了我们开发的全基因组微阵列CGH技于发育迟缓或先天性异常个体的评估【10,11】。我们术作为一线检验在围产期病例中的有用性。在临床特征的小组成功开发并验证了一种以细菌人工染色体（BAC）有差异的患者中，微阵列CGH技术检测节段性缺失和染为基础的微阵列CGH分析平台，包括了分析软件【1色体重复的能力已经获得增强，而且该技术正在成为一2】。这种BAC阵列CGH分析平台依据了1440种经荧光
原位杂交（FISH）验证的BAC克隆，这些克隆是从亚洲项更加有效的工具，用于围产期的诊断。
基因组计划【13】构建的10万种BAC克隆中筛选出来的，并通过末端测序和FISH进行了验证。该阵列CGH包括了整个基因组区域，包括了356种和细胞生长相关背景
微阵列比较基因组杂交（CGH）是一种全基因组筛选技的主要基因以及超过40种已知的DNA拷贝数目改变障
碍。在本研究中，我们使用这种新研发的阵列CGH技术术，可用于检测染色体障碍及癌症研究中的DNA拷贝
对5080份临床围产期病例进行了检测，确定了114种异数目的变异【1-4】。染色体异常是人类遗传病中很多
先天性和发育异常的主要病因，包括外形不正常、智力常病例，其中75种为出生前病例，39种为出生后病例。发育延迟、发育迟缓和多种先天异常。核型分析曾经是我们的结果支持使用微阵列CGH技术检测围产期临床病围产期诊断的金标准。如果使用传统的细胞遗传学技术，例的染色体DNA拷贝数变异。只有3-5Mb以上的染色体异常，如非整倍体和节段性异
材料和方法1) 临床样本
我们对2007年4月至2009年12月在MG MED实验室进行微阵列CGH分析的5080份临床病例的结果进行了分析，其中有4073份出生前样本（4033份羊水【AF】样本和40份绒毛膜绒毛【CV】样本）和1007份出生后样本（407份外周血【PB】样本和600份脐血【CB】样本）。4073份出生前病例进行该分析的原因是家族史、高龄产妇、胚胎超声异常、血清甲胎蛋白升高及父母意愿。407份出生后病例进行该分析的原因主要为发育迟缓、智力发育延迟及各种先天异常。600份产后脐血样本主要采自脐血库，用于基因组失衡的检测，该检测需由产科、儿科或遗传病专科医生申请。实验前，所有样本均采用既往描述的方法精心制备【12】。本研究获得了相应的伦理学审批，遗传学检查前所有患者也均提供了知情同意书。
点，而每个微阵列均采用GenePix4000B扫描仪（Axon Instruments, Foster City, CA, USA）进行扫描，并用微阵列软件分析（MAC VIEWER, Macrogen, South Korea）。芯片会自动测定每种样本的绿（试验DNA）红（参比DNA）（G/R）比值，经过标准化后的G/R比值代表检测序列和对照序列相比的相对平均拷贝数目。G/R比值超过均数加2.5个标准差（1.25）则认为所选拷贝数目放大或获得相应的拷贝数目；而小于均数减2.5个标准差（-0.75）则认为拷贝数丢失。
4) 核型及区域特异性探针FISH分析
采用患儿及其父母的羊水和外周血样本培养细胞，随后根据标准方法进行染色体分析。采用G带技术对有丝分裂中期的样本进行分析。采用特殊探针对分裂间期和分裂期的样本进行FISH研究，并按制造商的说明（Macrogen）操作。对特异的BAC克隆进行FISH分析以便对微阵列CGH分析进行验证。FISH操作主要采用两种颜色的探针进行；特异性BAC探针采用Cy3标记，为红色，对照组探针采用FITC标记，为绿色。采用BAC克隆DNA（NCBI build35）构建特异性BAC探针。采集各患儿及其父母的羊水及外周血淋巴细胞并培养出有丝分裂期染色体，随后采用FISH进行分析。随后采用CytoVision系统（应用成像，Santa Clara, CA, USA）获取有丝分裂期的图片并进行核型分析。根据国际人类细胞遗传学命名系统（ISCN，2009）的意见对核型进行鉴定。
2) 微阵列CGH分析平台的开发
我们开发了一种以BAC为基础的微阵列CGH分析平台，用以检测人体遗传疾病中的基因组失衡【12】。我们的微阵列CGH芯片包括1440种无重叠的BAC克隆（MACArrayKaryo1440 BAC-chip, Macrogen, Seoul, South Korea）。所有1440种克隆的位置见以下网站（http://www.macrogen.co.kr/eng/biochip/genelist_overview.html），这些克隆是从亚洲基因组计划中构建的10万种BAC克隆中筛选出来的【13,14】，随后进行了仔细的定位、末端测序，并通过FISH进行了荧光标记。所
有克隆均采用了ABI PRISM 3700DNA分析仪（Applied 结果
微阵列CGH是现有的检测基因组改变的最有效的方法。Biosystems, Foster City, CA）进行了两端测序，随后
我们采用CGH微阵列芯片在5080份围产期病例中进行根据圣克鲁斯加利福尼亚大学（UCSC）人类基因组数
据库（http://www.genome.ucsc.edu/）的描述，对其了全基因组微阵列CGH分析，该芯片含有1440个克隆，序列进行了分析并定位。根据既往描述的标准FISH技术，包括了40个染色体障碍特异性基因位点以及356种细胞我们进行了个别检测，移除了多位点结合克隆，确认了生长相关基因，这些克隆均来自BAC文库（表1）。我
们同时还进行了FISH和G带分析，证实了微阵列CGH显所选克隆的位点特异性。
示为异常的结果。我们对所有产前病例进行了微阵列CGH及核型分析。在产后病例中，我们尽可能的详细明3) 微阵列CGH和数据分析
采用PureGene试剂盒（GentraSystems, Minneapolis, 确了基因型和表现型之间的相互关系。
MN）从AF、CB、PB和CV中提取DNA。DNA提取后，在4073份产前病例中（4033份AF和40份CV样本）共明我们用Cy3-dCTP和Cy5-dCTP（Perkin Elmer）对50-5确了75份阳性病例（75/4073=1.8%），这些病例存在
DNA拷贝数目的变异；其中60例为非整倍体，7例有染00纳克的试验及参比DNA进行了标记，标记方法为随
机引物法，采用Exo-KlenowFragment（Invitrogen, C色体缺失，8例有重复染色体（表2）。36份病例有常
染色体非整倍，而24例有性染色体非整倍。核型分析arlsbad, CA）按照制造商说明进行标记，共16小时。
本文报道的结果来自BAC芯片检测的围产期病例。采用检测的染色体重排的总检出率为3.8%（155/4073），chromofluor图像分析系统（微阵列分析；Macrogen, 其中包括平衡易位和倒位。在产前病例中，我们明确的South Korea）对微阵列CGH芯片的结果进行分析。玻缺失和微缺失断点有：2q13、7q11.23、17p11.2、Xp
22.31和Xq24qter，确定的重复或微重复染色体有（1q片包含1440种人类BAC克隆，包括了40种以上的染色
体障碍的特异基因位点以及356种细胞生长相关基因，42q44、15q11.2q12、21q11.2、Xp22.31、Xp21.2和X这些信息均来自BAC文库，其对整个基因组的平均分辨q27.2qter）。有两例患儿出现了2q13杂合性微缺失，率为2.3Mb。构建BAC文库的人类DNA来自从韩国男性该区域包括Joubert综合征（2q13纯合性缺失）的关键取出的精子。每种BAC克隆在微阵列中均有三个重复位区域。这两名标志性染色体病例的微阵列CGH结果正常。
这两例标记染色体似乎含有异染色质，或者可能是微阵列CGH的涵盖范围有限所致。
这两例标记染色体似乎含有异染色质，或者可能是微阵列CGH的涵盖范围有限所致。总共对1007份产后病例（407份PB和600份CB样本）进行了研究，其微阵列CGH、核心和FISH的检测结果均完全一致。产后病例共出现了39份阳性样本，其中有5例非整倍体，23例染色体缺失及11例重复染色体（表3）。我们共明确了17种缺失/微缺失断点和7种重复/微重复染色体。在407份PB样本中，最常见的需要遗产学会诊的原因为发育迟缓、智力发育延迟、先天性异常和外貌异常。在407份具有临床适应症的PB样本中，我们共明确了34份染色体缺失/重复病例（34/407=8.3%）。600份脐血样本采自脐血库，需要进行基因组失衡的筛选，其中我们发现了4种染色体缺失（15q11.2、22q11.2和Xp11.2petr）和1例染色体重复病例（2q13）（5/600=0.83%）。在染色体缺失（微缺失）和重复染色体（微重复）方面，有34份病例存在染色体节段的增加或丢失，包括Wolf-Hirschhorn综合征（WHS）（4p16.3）、Cri-du-chat综合征（5p15.3）、Sotos综合征（5q35.3）、William综合征（7q11.23）、Digeorge综合征（10p14）、Prader
Willi/Angelman综合征（15q11.2）、Digeorge综合征（22q11.2）、类固醇硫酸酯酶缺乏（Xp22.31）、猫眼综合征（22q11.2）及Emanuel综合征（22q11, 11q23）。我们进行了微阵列CGH分析，其分子遗传学结果见图1（产前染色体缺失及重复病例举例）及图2（产后染色体缺失及重复病例举例）。我们还评估了产后病例的临床特点。例如，产后10号患者患有Sotos综合征，该患为1.1岁男性，出生体重为4.1千克。其颜面部特征非常典型，包括巨头畸形、额颞部毛发稀疏、前额突出、脸部狭长、尖下颏、身材过高、手掌过大以及牛奶咖啡斑。我们不仅鉴定出了单纯染色体缺失或重复，还明确了多种拷贝数目异常，包括各种染色体重排（产后第4、24、27和30号病例）。此外，还鉴定出产后4号病例具有多重染色体重排。虽然我们通过微阵列CGH检出了2q14q21.1缺失，但是我们可以通过同时进行的核型分析确定其准确的细胞遗传学特征，分别为46,XY, der(2)t(2;6) (q21.1;q23)inv(2)(q14.1q37)和der(6)t(2;6)(q21.1;q23)（数据未列出）。在第30号病例中，我们鉴定出了两种小的额外标记染色体（sSMC），为47,XX, +der(22) t(11;22)(q23;q11)，并伴有智力发育迟缓（图2）。
PB，外周血；CB，普通人群中收集储存的脐血
a 和微阵列CGH分析一起进行的核型及FISH分析。FISH分析采用特殊的细菌人工染色体（BAC）克隆进行。
b AF，羊水（4033例）；CV，绒毛膜绒毛（40例）
c 临床适应症：发育迟缓，智力发育延迟、外形异常、多种先天性异常等。
a 数据采编自4033份AF和40份CV样本进行的微阵列CGH和细胞遗传学分析，产前检验的主要适应症为高龄产妇、胚胎超声检查异常以及血清甲胎蛋白升高。b log2 绿/红（G/R）平均比值超过均数+2.5个SD（-0.25）则认为所示拷贝数目放大或获得所示拷贝，如果均数-2.5个SD（-2.5）则认为拷贝数目丢失。c 所用方法为核型和FISH分析。FISH分析采用特殊BAC克隆进行。d结构平衡的重排（倒位及易位）。
DD，发育迟缓；MR，智力发育延迟；IA，肛门闭锁；CP，腭裂；WHS，Wolf-Hirschhorn综合征；DGS，DiGeorge综合征；PWS，Prader-Willi综合征；ADHD，注意缺陷-多动障碍；PD，色素沉着障碍a 数据采集子407份PB和600份CB样本。
b log2 log2绿/红（G/R）平均比值超过均数+2.5个SD（-0.25）则认为所示拷贝数目放大或获得所示拷贝，如果均数-2.5个SD（-2.5）则认为拷贝数目丢失。
c 所用方法为核型和FISH分析。FISH分析采用特殊BAC克隆进行。
讨论
在临床实践中，微阵列CGH发可实现高分辨率的基因组分析【15】。当前，很多商业和学术研究实验室均使用以BAC、低聚核苷酸或SNP为基础的微阵列。阵列中探针的使用数目和类型以及在基因组上的设计决定了阵列的分辨率。目前上市销售的BAC阵列（针对靶向或全基因组）通常含有600至5200个BAC克隆（如PerkinElmer）。我们的全基因组BAC微阵列CGH平台是以1440种经荧光原位杂交（FISH）验证的BAC克隆为基础设计的，这些克隆是从亚洲基因组计划【13,14】构建的10万种BAC克隆中筛选出来的，并经过了末端测序和FISH的验证。因此本研究中可采用FISH对微阵列CGH分析异常的结果进行确认，而在临床使用的转变过程中也存在BAC克隆。
在本研究中，我们给出了BAC全基因组微阵列CGH平台在大规模临床病例中的应用情况。既往产前研究报告的染色体异常的发生率为1.3%【16】。此外，既往产后研究显示，在需要进行细胞遗传学检测的儿童中，微阵列CGH加细胞遗传学分析可检出临床显著性染色体异常的比例为7%【16】。本研究中微阵列CGH的产前检出率为1.8%（75/4073），其具有临床适应症患儿的产后检出率为8.3%（34/407例）（表1）。这些结果和既往的报告一致【17】。在产前病例中我们鉴定出了11种DNA拷贝数目改变，包括5种微缺失和6种微重复。因为传统细胞遗传学技术很难检出微缺失/重复这样的染色体异常，因此微阵列CGH分析更显得有用。我们还对致病变异进行了分类。在病例14（2q13缺失）中，我们采用FISH分析确定了一种杂合性缺失。该位点的纯合性缺失（2q13缺失）是Joubert综合征的致病变异【18】。我们还鉴定出了15q11.2和22q11.2两个染色体重复（病例20和21）。这些拷贝数目重复的表现型一般都很轻微，而且变异度很大；可表现为外观正常至智力发育延迟、生长迟缓和自闭症（15q11.2重复）。因此必须对产前微阵列CGH的结果进行是否是良性变异或致病性变异的评估。目前已经存在很多有用的拷贝数目变异数据库网站，如基因组变异数据库（http://projects.tcag.ca/variation/）、DECIPHER（http://decipher.sanger.ac.uk/）和Genereviews（http://www.genetests.org/），后者在临床上非常有用，可列出相关遗传疾病的表现型、基因型及致病性拷贝数目变异性疾病的临床治疗。很多已知的微缺失综合征其外显率均不完全【19】，而很多染色体重复的基因型和对应的缺失相比一般都比较轻微，很难确定【20】。既往的一项研究提出了一种在临床背景下用于微阵列CGH的一种很有效的算法【21】。此外，美国医学遗传学协会还发布了有关微阵列CGH的使用指南【22,23】。重要的是，除了良性拷贝数目变异（CNV），FISH和亲代研究均可确定出显示拷贝数目异常的区域。产前染色体异常检出率的增加有助于患者在分娩前寻求遗传学检测【24,25】。
图1：病例17（A,C）和21（B, D）的微阵列CGH及FISH验证数据（表2）。（A）X染色体微阵列CGH结果。箭头显示类固醇硫酸酯酶缺乏症关键区域（Xp22.31）缺失，涉及STS基因。（B）22号染色体的微阵列CGH结果。箭头显示Digeorge综合征关键区域（22q11.2）重复。（C）使用Xp22.31特异性区域探针的FISH；箭头显示del(X)(p22.31p22.31)染色体探针（STS-）缺失。（D）使用22q11.2特异性区域探针的FISH；圆圈显示有丝分裂间期细胞内部探针（COMTⅹ3）的重复。
图2：病例30的微阵列CGH及细胞遗传学验证数据（表3）。（A），（B）11及22号染色体微阵列CGH的结果。箭头所示为11q23和22q11.2。（C）47,XX, +der(22)t(11;22)(q23;q11)G带核型分析结果。箭头所示为标记染色体。（D）使用11q23（绿色）和22q11.2（黄色）特异性区域探针进行的FISH；箭头所示为+der(22)t(11;22)(q23;q11)。
图3：病例10（A,C）和23（B,D）的微阵列CGH及FISH验证数据。（A）5号染色体的微阵列CGH结果。箭头所示为Sotos综合征关键区域（5q35.3）的缺失，涉及NSD1基因。（B）15号染色体的微阵列CGH结果。箭头所示为PWS/AS综合征关键性区域（15q11.2）的重复。（C）使用5q35.3特异性区域探针的FISH分析；箭头所示为del(5)(q35.3q35.3)染色体上出现了（NSD-1）探针缺失。FISH分析发现NSD1基因区域（红色信号）缺失-46, XY, ishdel(5)(q35.3q35.3)(D5S404+, NSD1-)。（D）使用15q11.2特殊区域探针的FISH分析；箭头所示为有丝分裂间期细胞内探针（SNRPNⅹ3）的重复。
在产后病例中我们共确定了17种缺失和微缺失的断点、7种重复和微重复染色体以及3种SMC。在39例产后阳性病例中，有5例为非整倍体，23例为染色体缺失，而11例为染色体重复（表3）。绝大多数产后病例均有发育迟缓和智力发育延迟的临床适应症。因此，在产后病例中，采用微阵列CGH分析获得的染色体异常检出率要复是一种良性的拷贝数目变异，在拷贝数目变异库中有所展示（http://projects.tcag.ca/variation/）。
此外，在微阵列CGH作为一线检验用于临床诊断前，还有必要讨论一下其局限性。微阵列CGH不能检出多倍体、平衡易位、倒位和低水平嵌合体。根据标记染色体大小、高于产前病例。在本研究中，我们分析了具有临床适应症或未知特殊适应症的不同患者。我们检出1例患者（病例5）具有3q24缺失，该患患有发育迟缓、肛门闭锁和腭裂。3q24-q26区域的缺失包括Dandy-Walker畸形（DWM）的关键区域（3q24），该区域的缺失会出现一系列与Dandy-Walker畸形相似的表现，如颅面部畸形（鼻梁宽阔及塌陷，耳部位置较低并向后旋转）、智力发育延迟、先天性心脏缺陷及中枢神经系统畸形【26】。既往一项研究通过对数名DWM患者的3q24中间缺失定位，报告了和DWM相关的关键区域【27】。在病例10中，我们鉴定出了5q35区域的微缺失，涉及NSD1基因，该患为1名患有Sotos综合征（图3）的韩国患者。日本Sotos综合征患者最常见的突变（50%）为5q35区域的微缺失，涉及NSD1基因，而在英国，约有70%的患有Sotos综合征患者为NSD1的点突变，仅有10%的患者出现5q35区域的微缺失【28】。因此，需要实施进一步的研究以便对韩国Sotos综合征患者有个更好的了解。最常见的缺失发生在Xp22.31区域。本研究中Xp22.31缺失患者（病例19和27）出现了鱼鳞癣、身材矮小及注意力缺陷多动障碍（ADHD）。Xp22.31缺失可导致STS基因的功能丧失，该基因和男性类固醇硫酸酯酶缺陷有关。STS基因编码类固醇硫酸酯酶，这是一种膜结合微粒体酶，该酶表达非常广泛，主要用于几种3-β-硫酸羟基固醇的水解，而这些物质是雌雄激素和胆固醇的代谢前体【29】。既往一项研究报道了一名Xp22.3中间缺失的患者，该患存在鱼鳞病、外形异常、智力发育迟缓和ADHD【30】。我们鉴定出了1例15q11.2q12重复病例，该患患有发育迟缓、自闭症和色素沉着障碍（图3）。既往研究报告该患者患有婴儿孤独症，其染色体15q11-q13存在异常，该异常是自闭性障碍患者常见的异常【31】。我们鉴定出了三个标志物染色体起源（11、18和22号染色体）。sSMC起源分析对于临床表现型的评估非常重要。标记染色体的起源和大小可导致表现型的变异【32】。本研究鉴定出了22q11.2染色体重复，涉及CES基因和残余标记染色体衍生易位的两个染色体（22q11&11q23）（图2）。sSMCder(22)t(11;22)(q23;q11)和Emanuel综合征相关，该综合征的特征性表现为智力发育迟缓、小头畸形、生长迟缓、耳前赘或耳前窦、耳部异常以及腭裂或上颚拱起【33】。上述微阵列CGH和其它细胞遗传学结果均和猫眼综合征及伴有智力发育迟缓的Emanuel综合征的临床表现型相一致。我们通过脐血库脐血在表现型正常的个体中还鉴定出了CNV（2q13和4q32重复）。因为2q13重复的拷贝数目变异也可见于表现型正常和对照的个体中，因此其临床意义正在评估中【34】。4q32重
标志物组成和微阵列在标记染色体特殊区域上涵盖的范围不同，还可能遗漏标记染色体。此外，我们还需要考虑微阵列CGH检验的各种局限性（如点突变、单亲二倍体和相应的出报告时间）。因此，遗传学实验室必须同时能够进行微阵列CGH和传统的细胞遗传学分析（G带分析和FISH），包括分子遗传学试验（DNA测序），而且，临床遗传学医生应该能够提供适当的遗传学会诊，包括对结果的解释和试验对患者及家族成员的限制。结论
本研究证实，我们新近研发的微阵列CGH平台是一种非常有效的临床工具，并将全基因组微阵列CGH作为一线检验在5080例围产期病例中进行了应用。涵盖疾病特异性区域更广的微阵列CGH的应用以及和核型分析及FISH等其它细胞遗传学分析联合使用在各种染色体障碍的鉴定过程中非常有效。此外，这种新研发的微阵列CGH分析平台有助于对基因组障碍和DNA拷贝数目改变及基因型和表现型的关系。此外，有必要对所鉴定的基因进行功能性研究，以便进一步理解在各种DNA拷贝数目改变障碍的发生和发展过程中缺失或重复位点邻近基因的相关机制。
致谢
我们对He doo Chung医生在临床验证过程中的贡献和临床同事对本项研究的支持深表谢意。我们还感谢实验室其他同事的热情参与。
作者信息
13 韩国首尔韩国水原市亚洲大学医学院医学遗传学系。MG MED公司。2韩国首尔MACROGEN4 韩国梁公司。山市釜山大学医学院儿童医院儿科。5. 韩国京畿道国家癌症中心肿瘤诊断中心。
作者贡献
SJPGH撰写了草稿并进行了数据分析。H分析，进行了相关确认，并参与了分析。RSR实施了核型及FISH分析。EHJ实施了微阵列CBACHWK微阵列实施了CGHFIS平台的验证工作。JMK、HJK、CKC和SHH提供了临床信息并进行了评估和建议。HYK设计了试验，进行了数据分析，还对手稿进行了审核。所有作者均阅读并确认了最终的稿件。
竞争性利益声明
作者声明没有竞争性利益存在。
收稿：2011年03月30日；接受：2011年05月09日；出版：2011年05月09日
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